Diyabetik Sıçanların Dalağında CD4 ve CD8 Ekspresyonu Üzerine Zencefil (Zingiber officinale) Ekstraktının İmmünmodülatör Etkileri

Buket BAKIR

doi:10.4274/nkmj.galenos.2023.25991

ÖZET

Amaç:

Bu çalışmada, zencefil ekstrakt uygulaması ile streptozotosin ile deneysel diyabet oluşturulan ratların dalak dokusunda CD4 ve CD8 salınımındaki değişiklerin incelenmesi amaçlanmıştır.

Sonuç:

Zencefil ekstraktının deneysel yolla diyabet oluşturulan modelde immün sistemi uyarıcı etkiye sahip olduğu görülmüştür. Elde edilen sonuçlara göre, zencefil diyabetle ilişkili dalak sorunlarında ve bağışıklık fonksiyon bozukluğunda tedavi edici olarak kullanılabilir.

Bulgular:

Diyabet grubunda çok sayıda lenf folikülünün atrofiye uğradığı ve çoğu folikülün de germinal merkezinin olmadığı görüldü. Ayrıca, zencefil ekstraktının dejeneratif değişiklikleri azalttığı tespit edildi. Diyabet grubunda CD4 ve CD8 salınımının yoğun olduğu gözlenirken, diyabet+zencefil grubunda CD4 ve CD8 salınım yoğunluğunun diyabet grubuna göre azaldığı görüldü. Ayrıca diyabet grubunda azalan dalak ağırlığının diyabet+zencefil grubunda arttığı kontrol ve sham gruplarıyla benzer değerde olduğu tespit edildi.

Gereç ve Yöntem:

Çalışmamızda toplam kırk adet Wistar albino ırkı rat kullanıldı. Ratlar; kontrol, sham, zencefil, diyabet, diyabet+zencefil olmak üzere 5 gruba ayrıldı. Dalak doku kesitlerine Crossman’ın üçlü boyama ve streptavidin-biotin peroksidaz kompleks boyama yöntemleri uygulandı. Diyabet ve diyabet+zencefil gruplarına 50 mg/kg streptozotosinin intraperitoneal yolla enjeksiyonu ile diyabet indüklendi. Zencefil ekstraktı, zencefil ve diyabet+zencefil gruplarına 200 mg/kg dozunda 30 gün süreyle uygulandı. Gruplar arasında dalak ağırlığı, CD4 ve CD8 immünopozitif hücre sayısı ve CD4/CD8 oranı istatistiksel olarak analiz edildi.

Anahtar Kelimeler:

CD4, CD8, dalak, diyabet, zencefil

GEREÇ VE YÖNTEM

Çalışma, Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi Sağlık ve Deney Merkezi’nden temin edilen 40 adet dişi, 206±6 g, 4 aylık Wistar albino ratlar kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm deneyler Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından onaylandı (toplantı no: 09.11.2022/1153).

Ratlar daha önceden hiçbir çalışmada kullanılmadı ve standart kafeslerde sıcaklık kontrollü odada (22±2 °C), 12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde tutuldu ve standart rat peleti diyeti ve su ile ad libitum beslendi.

Zencefilin Etanolik Özünün Hazırlanması

Zencefil taze rizomları yerel bir mağazadan temin edildi ve Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi Botanik Bölümü’nde onaylandı. Zencefiller önce yıkanıp sonra karanlık bir odada kurutuldu. Kurutulmuş zencefil rizomları, bir porselen havanda mekanik olarak toz haline getirildi. Ortaya çıkan toz karışım %95 alkolde 24 saat bekletildikten sonra karışım süzüldü. Bu işlem toplamda 3 kez tekrarlandı. Hazırlanan tüm karışımlar bir araya toplandı ve düşük devirli evaporatörde alkol uzaklaştırıldı. Hazırlanan ekstrakt buzdolabında 4 °C’de olarak saklandı. Zencefil ekstraktı 200 mg/kg/bw/gün, daha önce bahsedilen metodolojiye göre 30 gün boyunca deney ratlarına ağızdan verildi¹⁴.

Diyabet İndüksiyonu

50 mg/kg streptozotosin (STZ) (Sigma, st. Louis, MO, ABD), 0.1 M sitrat tamponunda (pH 4.5) çözündürüldü. İntraperitoneal enjeksiyon (i.p.i.) bir gece aç kaldıktan sonra yapıldı. Uygulamadan 3 gün sonra sıçanların kuyruk venlerinden Accu-Chek instant glükometre (Roche) kullanılarak açlık kan glukoz değerleri ölçüldü. Kan şekeri >250 mg/dL diyabet gelişimi için bir gösterge olarak kabul edildi ve ratlar diyabetik gruplara dahil edildi¹⁵.

Deney Hayvanları ve Dizayn

Deney ratları 5 gruba ayrıldılar ve her gruba sekizer rat dahil edildi. Total deney protokolü 30 gün sürdürüldü. Deney grupları şu şekildeydi:

Kontrol (n=8): Uygulama yapılmadı (tedavi edilmeyen grup).

Sham grubu (n=8): Ratlara oral gavaj ile Tween 80 verildi.

Zencefil grubu (n=8): Taze zencefil ekstraktı (günlük hazırlanan) 200 mg/kg dozunda 30 gün oral gavaj ile verildi.

Diyabet grubu (n=8): Bu gruba 50 mg/kg i.p.i. STZ uygulandı.

Diyabet+zencefil grubu (n=8): Bu gruba diyabet geliştikten sonra 30 gün süreyle 200 mg/kg zencefil ekstraktı oral gavaj ile verildi.

Otuz günün sonunda ratlar derin anestezi altında ötenazi yapılarak dalak dokuları çıkarıldı.

Histolojik Prosedür

Dalak dokuları %10 formalinde 48 saat fikse edildi. Fiksasyondan sonra numuneler rutin histolojik protokoller için işlendi ve parafine gömüldü. 5 µm olarak alınan kesitler, ksilen içinde deparafinize edildi, azalan etanol konsantrasyonları ile rehidrate edildi ve histolojik inceleme için Crossman’ın üçlü boyama yöntemiyle boyandı¹⁶.

İmmünohistokimyasal Boyama

Dalakta CD4 ve CD8 T lenfosit immünreaktivitesini araştırmak için streptavidin biotin peroksidaz kompleksi (strepABC) yöntemi uygulandı. 5 µm kalınlığındaki kesitler, yapışkan lamlar üzerinde toplandı. Kesitler, sitrat tampon solüsyonunda (pH 6.0) 700 Watt’ta bir mikrodalga fırında 10 dakika süreyle işlendi. Daha sonra dokular %3’lük hidrojen peroksit (H₂O₂) içerisinde 10 dakika bekletildi. Kesitler, anti-CD4 antikoru (ab237722, 1:150 seyreltilmiş) ve anti-CD8 antikoru (OX-8) (ab33786, 1:150 seyreltilmiş) ile inkübe edildi. Kesitler, biyotinlenmiş goat anti-rabbit ve rabbit anti-goat IgG ile 30 dakika ve peroksidaz konjuge streptavidin (1:200) (P0397; Dako Corp., Carpinteria, CA, ABD) ile 10 dakika inkübe edildi. Kromojen olarak 3,3’-Diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB, 0,5 mg/mL; Dako Corp.) kullanıldıktan sonra karşıt boyama olarak Gill III hematoksilin kullanıldı. Kesitler ışık mikroskobu (Olympus BX51, Tokyo, Japonya) kullanılarak değerlendirildi. Primer antikor içermeyen tavşan serumu, negatif kontrol olarak kullanıldı. CD4 ve CD8’in immünoreaktivitesinin değerlendirilmesi puanlandı. İmmünoreaktif hücreler negatif, hafif, orta ve yoğun olarak kategorize edildi.

İmmünohistokimyasal Boyamanın Değerlendirilmesi

CD4 ve CD8’in immünohistokimyasal boyama sayısı, x400 büyütmede ışık mikroskobu kullanılarak incelendi ve fotoğraflandı. Her rattan toplam on beş temsili görüntü seçildi. Birim alandaki CD4 ve CD8 pozitif ve negatif hücre sayısı şu formüle göre hesaplandı: (Pozitif hücre sayısı/alanda sayılan toplam hücre sayısı) x100. CD4 ve CD8 pozitif hücre sayısı ve CD8/CD8 oranı istatistiksel olarak analiz edildi^3,17,18.

Rölatif Dalak Ağırlığı

Ratlara ötenazi yapıldıktan hemen sonra taze dalaklar tartıldı. Gruplar arasında dalak ağırlığındaki değişikliği karşılaştırmak için istatiksel yöntem kullanıldı.

İstatistiksel Analiz

İstatistiksel analiz Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) (versiyon 20.0, IBM, SPSS Inc., Chicago, ABD) kullanılarak yapıldı. Veriler normallik dağılımı ve varyans homojenliği açısından Shapiro-Wilk’s testi ile incelendi. Normal dağılıyorsa one-way ANOVA testi uygulandı ve gruplar arasındaki farklar post-hoc Tukey testi ile analiz edildi. Farklılıklar p<0,05’te anlamlı kabul edildi ve ortalamalar ve standart hatalar hesaplandı. Çalışmada veriler normal varsayımları sağlamadığından parametrik olmayan testler kullanıldı. Bu nedenle gruplar arasındaki farklar Kruskal-Wallis ile analiz edildi ve gruplar arasında Mann-Whitney U testi kullanıldı. Ayrıca farklar p<0,05’te anlamlı kabul edildi ve medyan değerler (minimum-maksimum) hesaplandı.

BULGULAR

Histolojik Bulgular

Kontrol, sham ve zencefil grupları, dalağın normal histolojik yapısına sahipti. Doku dışarıdan bir kapsülle çevriliydi. Kapsülden ayrılan trabeküller dalak parankimine kadar uzanıyordu. Dalak, ayrılmış lenfoid foliküllerden (beyaz pulpa) oluşuyordu ve oldukça vasküler matris (kırmızı pulpa) ile çevriliydi. Beyaz pulpa, periarteriolar lenfatik kılıf ve marjinal bölgelerden oluşuyordu. Lenfoid foliküllerin germinal merkezleri ve merkezi arteriyolleri vardı. Kırmızı pulpa, kan hücreleri kordonlarından oluşan bir ağdan oluşuyordu (Şekil 1a-c). Diyabet grubunun lenfoid foliküllerinin atrofik olduğu görüldü. Foliküllerin çoğunda germinal merkez yoktu (Şekil 1d). Diyabet+zencefil grubu, kontrol, sham veya zencefil gruplarındakine benzer şekilde beyaz ve kırmızı pulpa olarak gözlendi. Foliküllerin çoğu germinal merkeze sahipti (Şekil 1e).

İmmünohistokimyasal Bulgular

Tüm gruplarda spesifik CD4 ve CD8 immünreaksiyonları görüldü. Ancak immünreaksiyon pozitif hücrelerin şiddeti açısından gruplar arasında fark vardı.

CD4 ve CD8 T lenfositleri çoğunlukla kırmızı pulpada ve birkaç pozitif hücre beyaz pulpada lokalize idi. Kırmızı pulpada kontrol ve sham gruplarında hafif reaksiyon gözlendi (Şekil 2a, 2b, 3a, 3b). Zencefil grubunun hücrelerde orta derecede reaksiyona ve birkaç hafif reaksiyona sahip olduğu görüldü (Şekil 2c, 3c). Diyabet grubunda yoğun reaksiyon dikkat çekerken (Şekil 2d, 3d), diyabet+zencefil grubunda orta düzeyde reaksiyon görüldü (Şekil 2e, 3e).

İmmünohistokimyasal Bulguların Değerlendirilmesi

Bulgularımıza göre diyabet grubunda CD4 ve CD8 immünopozitif hücre sayısının kontrol, sham ve zencefil gruplarına göre anlamlı artış gösterdiği gözlendi (p<0,0001). Zencefil ile tedavi edildikten sonra diyabet+zencefil grubunun diyabet grubuna göre anlamlı düşüş gösterdiği gözlendi (CD4 ve CD8 için p<0,0001). CD4 ve CD8’in tüm verileri Tablo 1’de gösterilmiştir.

Bu çalışmada CD4/CD8 oranında oldukça anlamlı bir artış saptandı (p=0,002). Kontrol (p=0,002) ve sham grubuna göre (p=0,001) diyabet grubunda anlamlı azalma olurken, diyabet+zencefil grubunda anlamlı olmayan bir artış oldu (p>0,05) (Tablo 1).

Dalak Ağırlığı Bulguları

Tüm gruplar dalak ağırlığı açısından karşılaştırıldığında diyabetli grupta anlamlı azalma saptandı. Ayrıca diyabet+zencefil grubu diyabet grubu ile karşılaştırıldığında dalak ağırlığında anlamlı artış saptandı (p<0,05). Gruplar arasında ortalama dalak ağırlığı değerlerinin karşılaştırılması Şekil 4’te gösterilmiştir.

SONUÇ

Çalışmada deneysel diyabetli ratlarda CD4 ve CD8 ekspresyonunun arttığı belirlendi. Otuz gün süreyle 200 mg/kg zencefil uygulaması ile CD4 ve CD8 ekspresyonlarının kontrol grubu ile eşdeğer olduğu gözlendi. Zencefilin diyabetin neden olduğu olumsuz etkileri ortadan kaldırmada etkisi olduğu ve immünomodülatör olarak kullanılabileceği belirlenmiştir.

Teşekkür

Doç. Dr. Nilay SEYİDOĞLU’na çalışmanın istatistiksel analizlerine katkılarından dolayı teşekkür ederim.

Etik

Etik Kurul Onayı: Tüm deneyler Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından onaylandı (toplantı no: 09.11.2022/1153).

Hasta Onayı: Hayvanlar üzerinde yapılmıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Finansal Destek: Bu çalışma, Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fonu’ndan alınan hibe (hibe numarası: NKUBAP.10.GA.18.147) tarafından mali olarak desteklenmiştir.

Kaynaklar

George B, Cebioglu M, Yeghiazaryan K. Inadequate diabetic care: global figures cry for preventive measures and personalized treatment. EPMA J. 2010;1:13‑8.

Alshathly MR. Efficacy of Ginger (Zingiber officinale) in Ameliorating Streptozotocin‑Induced Diabetic Liver Injury in Rats: Histological and Biochemical Studies. J Microsc Ultrastruct. 2019;7:91-101.

Said HM, Abdelaziz HO, Abd Elhaliem NG, Mohammed SA. A Comparative Study between Ginger and Echinacea Possible Effect on the Albino Rat Spleen of Experimentally Induced Diabetes. Egypt J Histol. 2020;43:763-76.

Kavazović I, Krapić M, Beumer-Chuwonpad A, Polić B, Turk Wensveen T, Lemmermann NA, et al. Hyperglycemia and Not Hyperinsulinemia Mediates Diabetes-Induced Memory CD8 T-Cell Dysfunction. Diabetes. 2022;71:706-21.

Widyaningsiht TD, Martati E, Lukitasari DM. Immunomodulatory effects of black cincau (Mesona palustris bl.) Supplement on Escherichia coli Strain O157-Infected Mice. Asian J Pharm Clin Res. 2017;10:326-30.

Sasmito E, Nunung Y, Soegihardjo CJ. The immunomodulatory mechanism extract of mengkudu (Morinda Citrifolia, L.) fruit on mice Balb/C induced by hepatitis b vaccine. Tradit Med J. 2008;13:1-8.

Krifa M, Bouhlel I, Ghedira-Chekir L, Ghedira K. Immunomodulatory and cellular anti-oxidant activities of an aqueous extract of Limoniastrum guyonianum gall. J Ethnopharmacol. 2013;146:243-9.

Boothapandi M, Ramanibai R. Immunomodulatory activity of Indigofera tinctoria leaf extract on in vitro macrophage responses and lymphocyte proliferation. Int J Pharm Pharm Sci. 2016;8:58-63.

Jafarzadeh A, Nemati M. Therapeutic potentials of ginger for treatment of Multiple sclerosis: A review with emphasis on its immunomodulatory, anti-inflammatory and anti-oxidative properties. J Neuroimmunol. 2018;324:54-75.

Lee S, Khang D, Kim SH. High dispersity of carbon nanotubes diminishes immunotoxicity in spleen. Int J Nanomedicine. 2015;10:2697-710.

Zhao H, Han H, Hou H, Chen J, Lang X, Yue Y, et al. Effect of ginkgo biloba extract on splenic immune function of chronic ulcerative colitis in mice. Int J Clin Exp Med. 2017;10:7611-23.

Kakoola DN, Lenchik NI, Curcio-Brint A, Gerling IC. Transcriptional profiling of CD4 T-lymphocytes reveals abnormal gene expression in young prediabetic NOD mice. BMC Bioinformatics. 2009;10(Suppl 7):15.

Arnush M, Scarim AL, Heitmeier MR, Kelly CB, Corbett JA. Potential role of resident islet macrophage activation in the initiation of autoimmune diabetes. J Immunol. 1998;160:2684-91.

Shanmugam KR, Ramakrishna CH, Mallikarjunaa K, Reddy KS. Protective effect of ginger against alcohol-induced renal damage and antioxidant enzymes in male albino rats. Indian J Exp Biol. 2010;48:143-9.

Francis BT, Sudha S. Histopathological changes on streptozotocin induced diabetic rats following administration of polyherbal extract: A study on pancreas and kidney. World J Pharm Pharm Sci. 2016;5:1188‑200.

Crossman G. A modification of Mallory’s connective tissue stain with a discussion of the principles involved. Anat Rec. 1937;6:33-8.

Hashem MM, Abo-El-Sooud K, Abd-Elhakim YM, Badr YA, El-Metwally AE, Bahy-El-Dien A. The long-term oral exposure to titanium dioxide impaired immune functions and triggered cytotoxic and genotoxic impacts in rats. J Trace Elem Med Biol. 2020;60:126473.

Khayal EE, Alabiad MA, Elkholy MR, Shalaby AM, Nosery Y, El-Sheikh AA. The immune modulatory role of marjoram extract on imidacloprid induced toxic effects in thymus and spleen of adult rats. Toxicology. 2022;471:153174.

Grigore A. Phenolic Compounds - Biological Activity. In: Hernandez MS, Tenango MP (eds). Plant Phenolic Compounds as Immunomodulatory Agents. London: Intechopen, 2017.

Ebaid H, Al-Tamimi J, Metwalli A, Allam A, Zohir K, Ajarem K, et al. Effect of STZ-Induced Diabetes on Spleen of Rats: Improvement by Camel Whey Proteins. Pakistan J Zool. 2015;47:1109-16.

Ozdemir O, Akalın PP, Baspinar N, Hatipoğlu F. Pathological changes in the acute phase of streptozotocin-induced diabetic rats. Bull Vet Inst Pulawy. 2009;53:783-90.

Madkor HR, Mansour SW, Ramadan G. Modulatory effects of garlic, ginger, turmeric and their mixture on hyperglycaemia, dyslipidaemia and oxidative stress in streptozotocin-nicotinamide diabetic rats. Br J Nutr. 2011;105:210-7.

Al-Amin ZM, Thomson M, Al-Qattan KK, Peltonen-Shalaby R, Ali M. Anti-diabetic and hypolipidaemic properties of ginger (Zingiber officinale) in streptozotocin-induced diabetic rats. Brit J Nutr. 2006;96:660-6.

Zhu J, Chen H, Song Z, Wang X, Sun Z. Effects of Ginger (Zingiber officinale Roscoe) on Type 2 Diabetes Mellitus and Components of the Metabolic Syndrome: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Evid Based Complement Alternat Med. 2018;5692962.

Weidner MS, Sigwart K. Investigation of the teratogenic potential of a zingiber officinale extract in the rat. Reprod Toxicol. 2001;15:75-80.

Kumari J, Selvan SR, Becart S, Chattopadhyay S, Dalmo RA. Cell-mediated immunity and vaccines. J Immunol Res. 2014;2014:632632.

Miya A, Nakamura A, Miyoshi H, Takano Y, Sunagoya K, Hayasaka K, et al. Impact of Glucose Loading on Variations in CD4+ and CD8+ T Cells in Japanese Participants with or without Type 2 Diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 2018;9:81.

Hedman M, Faresjö M, Axelsson S, Ludvigsson J, Casas R. Impaired CD4+ and CD8+ T cell phenotype and reduced chemokine secretion in recent-onset type 1 diabetic children. Clin Exp Immunol. 2008;153:360-8.

Shieh SJ, Varkey P, Chen PY, Chang SY, Huang LL. Counting CD4(+) and CD8(+) T cells in the spleen: a novel in vivo method for assessing biomaterial immunotoxicity. Regen Biomater. 2014;1:11-6.

Li C, Gao Q, Jiang H, Liu C, Du Y, Li L. Changes of macrophage and CD4+ T cell in inflammatory response in type 1 diabetic mice. Sci Rep. 2022;12:14929.