Farklı Glioma Alt Tiplerinde Sitoprotektif NRF2/KEAP1/P62/ SQSTM1 Sinyal Yolunun Mutasyon ve Ekspresyon Profilinin Karşılaştırmalı Analizi: Bir In Silico Çalışma

Dilara Fatma AKIN; Sedef Hande AKTAŞ

doi:10.4274/nkmj.galenos.2023.74745

ÖZET

Amaç:

NRF2/KEAP1/p62/SQSTM1 sinyalizasyon yolağı redoks homeostazında önemli rol oynayan antioksidan enzimlerin ve detoksifikasyon proteinlerinin ana düzenleyicisidir. Yapısal olarak aktif NRF2/KEAP1 yolağının, tümörigenezi ve metastatik süreçleri inhibe ettiği ve kemorezistansı teşvik eden hayatta kalma yanlısı genleri indüklediği için kanserde çok önemli bir role sahip olduğunu göstermektedir. Yolağın fonksiyonunun bozulduğu moleküler mekanizmalar ile beyin tümörleri gelişimi arasındaki ilişki tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu çalışmanın amacı NRF2/KEAP1 yolağının genetik değişikliklerini ve ifade seviyesi farklılıklarını düşük dereceli glioma (LGG) ve glioblastoma multiform (GBM) patolojisinde karşılaştırmalı olarak analiz etmektir.

Sonuç:

NRF2/KEAP1/p62/SQSTM1 sinyalizasyon yolağı anomalilerinin hedeflenmesi ile glioma tedavisinde özellikle kemoterapi duyarlılığı için yeni terapötik yaklaşımlar sağlanabilir.

Bulgular:

Her iki kanser grubu için KEAP1, NRF2, p62/SQSTM1, HMOX-1 ve MOAP1 genlerinde toplam 16 (12 missense mutasyon, 1 nonsense mutasyon, 1 delesyon, 2 translokasyon) mutasyon ve gen amplifikasyonu belirlendi ve mutasyon taşıma sıklığı %4,6 idi. LGG’li 1 hastada IDH1 R132H ve NRF2 S164* mutasyon birlikteliği belirlendi. LGG ve GBM alt tiplerinin her ikisi için de KEAP1, NRF2 ve HMOX1 gen ekspresyon seviyeleri, hasta örneklerinde sağlıklı örneklere göre yüksek olarak belirlendi (p<0,05).

Gereç ve Yöntem:

GBM ve LGG hastalarına ve sağlıklı doku örneklerine ait gen ekspresyon profilleri ve DNA dizileri, kanser genom atlas veri tabanından indirildi. KEAP1, NRF2, p62/SQSTM1, HMOX-1 ve MOAP1 genlerinin mutasyon ve ifade profilleri kapsamlı olarak analiz edildi. Çalışmada sadece gen ekspresyonu ve mutasyon paternlerinin tespiti değil, aynı zamanda hedef genlerin sağkalım üzerine olan etkileri de belirlendi. Ayrıca belirlenen değişikliklerin hastalık yapıcı patojenik özellikleri tahmini için PolyPhen-2 ve SNAP araçları kullanıldı.

Anahtar Kelimeler:

NRF2/KEAP1/p62/SQSTM1 yolağı, glioma, mutasyon, gen ekspresyonu, oksidatif stress

GEREÇ VE YÖNTEM

Veri Toplama

Glioblastoma multiform (GBM) ve düşük dereceli glioma (LGG) veri setleri cbioPortal veri tabanından temin edilmiş olup, hasta grubumuza ait demografik, klinik ve genetik veriler Tablo 1’de özetlenmiştir.

Mutasyon Profil Analizi

cBio Cancer Genomics Portal (http://cbioportal.org), mutasyon verilerini sağlamak için Kanser Genom Atlas’tan (TCGA) alınan verileri kullanan açık erişimli bir biyoinformatik araçtır¹³. GBM (n=591) ve LGG (n=511) hasta örneklemlerinde KEAP1, NRF2, p62/SQSTM1, HMOX-1 ve MOAP1’de bulunan mutasyonları kapsamlı bir şekilde incelemek için web arayüzünden ilgili kanser türü olarak seçildi. Bu amaçla ilgilenilen genlerin ara yüzünün sağladığı özellikler kullanılarak cBioportal ile kapsamlı mutasyon profil analizleri gerçekleştirildi.

Mutasyon Etkisinin In Silico Analizi

KEAP1, NRF2, p62/SQSTM1, HMOX-1 ve MOAP1’de bulunan mutasyonların olası patojenitesi, PolyPhen-2, SNAP ve COSMIC veri tabanlarından alınan puanlar kullanılarak belirlendi. PolyPhen-2, yanlış anlamlı mutasyonun proteine zarar verme olasılığını tahmin eder ve kullanıcıya bu sonucu (büyük bir olasılıkla zarar verici, muhtemelen zarar verici, benin veya bilinmeyen) bir skor ile verir¹⁴. SNAP, çeşitli dizi ve varyant özelliklerini göz önünde bulundurarak etki ve nötr varyantlar/eş anlamlı olmayan SNP’ler arasında ayrım yapan çevrimiçi bir araçtır¹⁵. Ayrıca, tespit edilen mutasyonlar COSMIC veri tabanında tarandı ve patojenite puanları belirlendi¹⁶. Ayrıca tespit edilen mutant amino asitlerin evrimsel koruma analizleri, PolyPhen-2’deki “çoklu dizi hizalama” ile farklı türler arasında değerlendirildi.

Gen Ekspresyonu ve Sağkalım Analizleri

GEPIA, tümör veya normal dokularda diferansiyel ekspresyon analizi, kanser türlerine veya patolojik evrelere göre profil oluşturma, sağkalım analizi, benzer gen tespiti ve korelasyon analizi gibi özelleştirilebilir analizler sağlamak için geliştirilmiş interaktif bir araçtır¹⁷. KEAP1, NRF2, p62/SQSTM1, HMOX-1 ve MOAP1 ekspresyonlarının profilleri, TCGA verilerinden elde edilen GBM (n=163), LGG (n=518) örneklemlerinin ve 207 sağlıklı dokunun verileri kullanılarak GEPIA ile oluşturulan kutu diyagram grafiklerinde analiz edildi. Farklı gen ekspresyon seviyelerine göre genlerin sağkalım analizleri (genel/hastalıksız) GEPIA kullanılarak yapıldı. Sağkalım grafikleri oluşturmak için %95 güven aralığına sahip Log-rank testine dayalı genel sağkalım (OS) ve hastalıksız sağkalım (DFS) analizleri yapıldı.

İstatistiksel Analiz

Çalışma verilerinin değerlendirilmesinde kullanılan tüm istatistiksel analizler GEPIA veri tabanında yapıldı. Diferansiyel ekspresyonu ölçmek için tek yönlü ANOVA testi kullanıldı. GEPIA, gen ekspresyonuna dayalı olarak nükssüz sağkalım olarak da adlandırılan OS veya DFS analizini yapar. GEPIA, hipotez testi için Log-rank testini, Mantel-Cox testini kullanır. Düşük ve yüksek ekspresyon gruplarını karşılaştırmak için Log-rank testi kullanıldı. Tüm testlerde istatistiksel olarak anlamlı değer p<0,05 olarak kabul edildi.

BULGULAR

Mutasyon Profil Analizi Bulguları

GBM ve LGG hasta örneklemlerinde KEAP1, NRF2, p62/SQSTM1, HMOX-1 ve MOAP1’deki genetik değişiklikleri belirlemek amacıyla 1106 hastanın genom dizilim verilerini analiz etmek için cBioPortal arayüzü kullanıldı. GBM ve LGG hastalarının %4,6’sında KEAP1, NRF2, p62/SQSTM1, HMOX-1 ve MOAP1’de en az bir genetik değişiklik olduğu bulundu. Tüm çalışma genlerinde toplam 16 genetik değişiklik (12 yanlış anlamlı, 1 anlamsız, 1 delesyon, 2 translokasyon) tespit edildi (Tablo 2). Analiz edilen genler arasındaki değişim sıklığı incelendiğinde hasta grupları arasında mutasyonu fazla olan genin KEAP1 (%1,7), mutasyonu az olan genin ise NRF2 (%0,4) olduğu belirlendi (Şekil 1). KEAP1’de herhangi bir nükleotit değişikliği saptanmazken, her iki glioma alt tipinde genin amplifikasyonu bulundu. GBM ve LGG hasta örneklemlerinde çalışma genlerine ait proteinlerin domainlerinde saptanan mutasyonların lokalizasyonu Şekil 2’de temsili olarak gösterilmiştir.

LGG Hastalarında Mutasyon Profil Analiz Bulguları

LGG genetik anomalilerini taşıma sıklığı %6,1 olarak belirlendi. LGG grubunda altı mutasyon (NRF2, p.S164*; SQSTM1, p.R107Q ve p.A2V; MOAP1, p.K164N ve p.R204T) tespit edildi. Bulgularımıza göre, NRF2 geninde bulunan anlamsız p.S164* mutasyonunun, NRF2 polipeptitinin 164. amino asitte erken sonlanmasına neden olduğu ve bunun sonucunda trunkat bir protein oluşumuna neden olduğu düşünüldü. Glioma için NRF2 p.S164* ve IDH1 p.R132H yanlış anlamlı mutasyon karakteristiğinin bir arada bulunduğu Astrositom alt tipinde bir hasta vardı.

Astrositom alt tipi SQSTM1 olan iki farklı hastada SQSTM1, p.R107Q ve p.A2V yanlış anlamlı mutasyonlar tanımlandı. p.A2V mutasyonunu taşıyan hastanın IDH1 p.R132H mutasyonunu da taşıdığı belirlendi. Nöral gelişimden sorumlu bir tirozin kinaz olan NTRK2 ile p62/SQSTM1 t (5;9) (q35;q21) füzyon geni, oligodendroglioma alt tipine sahip bir hastada tanımlandı. Astrositom alt tipinde IDH1 p.R132H yanlış anlamlı mutasyon taşıyan iki farklı hastada, apoptozda anahtar rol oynayan BH3 benzeri bir protein olan apoptoz modülatörü 1 (MOAP-1), PNMA alanında p.K164N ve p.R204T mutasyonları ile tanımlandı.

GBM Hastalarında Mutasyon Profil Analizi Bulguları

GBM genetik anomalilerinin taşıma prevalansı %3,5 olarak saptandı. GBM grubunda on mutasyon NRF2, p.E564K; p62/SQSTM1 p.R96Q; p.E280del, p.F193L; p.R183P, HMOX-1, p.A194T; p.F33L, TXNRD2-HMOX1 füzyon geni; MOAP-1, p.P45L; p.A111V tespit edildi. NRF2-p62/SQSTM1; HMOX1-MOAP1 birlikteliği olan mutasyon taşıma sıklığı, GBM hasta grubu için istatistiksel olarak anlamlıydı (sırasıyla p=0,037 ve p=0,055). p62/SQSTM1’de tanımlanan mutasyonlar, PBI, LIR ve TBS alanlarındaydı. p.R183P mutasyonu, TBS Alanındaydı. Aynı alanda p.F193L ve PBI alanında p.R96Q mutasyonu, IDH2 p.G383V ve p.K251N yanlış anlamlı mutasyonları taşıyan 23 yaşında bir kadın hastada tanımlandı. Aynı hastada DNA bağlama alanı p.E564K yanlış anlamlı mutasyonunda NRF2 olduğu belirlendi. SOSTM1 p.E280del çerçeve kayması delesyon, LIR alanındaydı. Ek olarak füzyon geni t(5;9)(q35;q21), nöral gelişimden sorumlu bir tirozin kinaz olan p62/SQSTM1 ve NTRK2 ile tanımlandı. HMOX1 mutasyonları sadece GBM hasta grubunda tespit edildi. HMOX-1’de tespit edilen tüm yanlış anlamlı mutasyonlar, Heme oksijeneaz alanında bulunuyordu. MOAP1’deki iki yanlış anlamlı mutasyon (p.P45L ve p.A111V), PNMA alanında tanımlandı.

Mutasyon Etkisinin In Silico Analizinin Bulguları

PolyPhen-2, SNAP Veri tabanı ve COSMIC programlarının analiz sonuçlarına göre çalışmamızda tespit edilen mutasyonlardan özellikle NRF2 p.E564K, SQSTM1 p.R96Q ve HMOX1 p.F33L mutasyonlarının, 1’e yakın olmaları ve “etkilenmeleri” nedeniyle skorlarının patojenik olabileceği ve hastalık yapıcı özelliklere sahip olduklarının öngörülebildiği belirlendi.

Özellikle Tablo 2’de GBM hasta grubunda bulunan mutasyonların tamamının patojenik olduğu görülmektedir. Çoklu dizi hizalama analizi sonucunda, tespit edilen 12 mutasyondan 10’unun, farklı türler arasında korunan kritik noktada bulunan amino asitlerini değiştirdiği keşfedildi. Ayrıca NRF2’de bulunan, p.E564K, p.S164*; SQSTM1 p.R96Q, p.R183P ve p.R107Q; HMOX1 p.A194T, p.F33L mutasyonları COSMIC veri tabanında somatik mutasyonlar olarak mevcuttur ve farklı solid kanser türleri için özellikle belirtilmektedirler.

Gen Ekspresyonu ve Sağkalım Analizi Bulguları

GBM (n=163), LGG (n=518) hastalarının sağlıklı gruba göre karşılaştırılması sonucunda KEAP1, NRF2, p62/SQSTM1, HMOX-1 ve MOAP1 gen ekspresyon profilleri belirlendi. Analiz sonuçlarına göre KEAP1, NRF2 ve HMOX1 ekspresyon seviyeleri hasta numunelerinde sağlıklı numunelere göre istatistiksel olarak anlamlı ve her iki kanser grubunda daha yüksek, MOAP1 ekspresyonu ise hasta numunelerinde sağlıklı gruba göre daha düşük bulundu (p<0,005) (Şekil 3). LGG grubundaki NRF2 için p değeri, OS analizi bulgularına göre anlamlı bulundu. Düşük düzeyde NRF2 ekspresyonuna sahip olanların, yüksek düzeyde olanlara göre istatistiksel olarak anlamlı derecede daha uzun OS süresine sahip olduğu bulundu (p=0,00027). Ancak DFS analiz sonuçlarımıza göre, LGG hasta grubunda yüksek NRF2 ekspresyonu, düşük NRF2 ekspresyonu olan bireylere göre istatistiksel olarak anlamlıydı (p=0,0011). HMOX1’in düşük gen ekspresyonuna sahip bireyler, LGG hasta grubunda yüksek gen ekspresyonuna (p=0,025) sahip olanlardan istatistiksel olarak anlamlı derecede daha uzun bir OS süresine sahipti. Düşük düzeyde MOAP1 ekspresyonu olan bireyler, yüksek düzeyde ekspresyona sahip olanlara göre daha uzun OS’ye sahipti (p=0,008, Şekil 4). SQSTM1 gen ekspresyonu düşük olan bireyler, GBM hasta grubunda gen ekspresyonu yüksek olanlara göre istatistiksel olarak anlamlı derecede daha uzun DFS periyoduna sahipti (p=0,0043, Şekil 5). Ayrıca, yüksek HMOX1 ekspresyonu seviyeleri dışında diğer tüm genlerde ve her iki kanser alt tipinde yüksek ekspresyon seviyelerine sahip bireyler, uzun OS’ye sahipti. Her bir gen için mutasyonlu ve mutasyonsuz bireylerin m-RNA düzeylerinin karşılaştırılması sonucunda gruplar arasında istatistiksel fark bulunmadı. Sonuçlar Şekil 5’te sunulmuştur.

SONUÇ

Aynı hasta popülasyonundan oluşturulan iki tümör grubundaki sağlıklı hasta örneklemlerine göre de gen ekspresyon analizleri yapıldı. Gen ekspresyon profilleri analizimizin bir sonucu olarak, sağlıklı NRF2, KEAP1 ve HMOX-1 örneklemleriyle karşılaştırıldığında bu yolağın her iki gliomada da yukarı regüle olduğu bulundu. MOAP1’in ekspresyon seviyesi, sağlıklı örneklem grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı derecede düşüktür (p<0,05). Ancak, SQSTM1’in ekspresyon düzeyinde herhangi bir önemli değişiklik tespit etmedik. Çalışmamız GBM ve LGG arasındaki moleküler farklılıkları ve ekspresyon profillerini belirleyerek yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesinde faydalı olabilecek sonuçlara sahiptir. Bu çalışma, gliomalarda saptanan NRF2/KEAP1/p62/SQSTM yolağı mutasyonlarının sıklığının ve moleküler özelliklerinin anlaşılması açısından önemlidir.

Teşekkür

Çalışmamızda kullanılan veriler TCGA Araştırma Ağı’nın halka açık veri tabanından elde edilmiştir: https://www.cancer.gov/tcga. Verilerin kullanılabilirliği için TCGA ve GEPIA veritabanlarına teşekkür ederiz.

Etik

Etik Kurul Onayı ve Hasta Onayı: In silico olarak biyoinformatik analiz edildiği için gerekmemektedir.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Yazarlık Katkıları

Konsept: D.F.A., Dizayn: D.F.A., Veri Toplama veya İşleme: D.F.A., S.H.A., Analiz veya Yorumlama: D.F.A., S.H.A., Literatür Arama: D.F.A., S.H.A., Yazan: D.F.A.

Çıkar Çatışması: Yazarlar bu makale ile ilgili olarak herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Finansal Destek: Çalışmamız için hiçbir kurum ya da kişiden finansal destek alınmamıştır.

Kaynaklar

Shulman RG, Rothman DL, Behar KL, Hyder F. Energetic basis of brain activity: implications for neuroimaging. Trends Neurosci. 2004;27:489-95.

Juurlink BH, Paterson PG. Review of oxidative stress in brain and spinal cord injury: suggestions for pharmacological and nutritional management strategies. J Spinal Cord Med. 1998;21:309-34.

Kanamori M, Higa T, Sonoda Y, Murakami S, Dodo M, Kitamura H, et al. Activation of the NRF2 pathway and its impact on the prognosis of anaplastic glioma patients. Neuro Oncol. 2015;17:555-65.

Ma S, Attarwala IY, Xie XQ. SQSTM1/p62: A Potential Target for Neurodegenerative Disease. ACS Chem Neurosci. 2019;10:2094-114.

Sajadimajd S, Khazaei M. Oxidative Stress and Cancer: The Role of Nrf2. Curr Cancer Drug Targets. 2018;18:538-57.

Taguchi K, Yamamoto M. The KEAP1-NRF2 System as a Molecular Target of Cancer Treatment. Cancers (Basel). 2020;13:46.

Panieri E, Saso L. Potential Applications of NRF2 Inhibitors in Cancer Therapy. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:8592348.

He F, Antonucci L, Karin M. NRF2 as a regulator of cell metabolism and inflammation in cancer. Carcinogenesis. 2020;41:405-16.

Akın-Balı DF, Aktas SH, Unal MA, Kankılıc T. Identification of novel Nrf2/Keap1 pathway mutations in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Pediatr Hematol Oncol. 2020;37:58-75.

Sanchez-Perez Y, Soto-Reyes E, Garcia-Cuellar CM, Cacho-Diaz B, Santamaria A, Rangel-Lopez E. Role of Epigenetics and Oxidative Stress in Gliomagenesis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2017;16:1090-8.

Ludwig K, Kornblum HI. Molecular markers in glioma. J Neurooncol. 2017;134:505-12.

Pölönen P, Jawahar Deen A, Leinonen HM, Jyrkkänen HK, Kuosmanen S, Mononen M, et al. Nrf2 and SQSTM1/p62 jointly contribute to mesenchymal transition and invasion in glioblastoma. Oncogene. 2019;38:7473-90.

Cerami E, Gao J, Dogrusoz U, Gross BE, Sumer SO, Aksoy BA, et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discov. 2012;2:401-4.

Adzhubei I, Jordan DM, Sunyaev SR. Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2. Curr Protoc Hum Genet. 2013;7:20.

Bromberg Y, Rost B. SNAP: predict effect of non-synonymous polymorphisms on function. Nucleic Acids Res. 2007;35:3823-35.

Tate JG, Bamford S, Jubb HC, Sondka Z, Beare DM, Bindal N, et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 2019;47:941-7.

Tang Z, Li C, Kang B, Gao G, Li C, Zhang Z. GEPIA: a web server for cancer and normal gene expression profiling and interactive analyses. Nucleic Acids Res. 2017;45:98-102.

Suzuki T, Yamamoto M. Molecular basis of the Keap1-Nrf2 system. Free Radic Biol Med. 2015;88:93-100.

Li K, Ouyang L, He M, Luo M, Cai W, Tu Y, et al. IDH1 R132H mutation regulates glioma chemosensitivity through Nrf2 pathway. Oncotarget. 2017;8:28865-79.

Khurshed M, Aarnoudse N, Hulsbos R, Hira VVV, van Laarhoven HWM, Wilmink JW, et al. IDH1-mutant cancer cells are sensitive to cisplatin and an IDH1-mutant inhibitor counteracts this sensitivity. FASEB J. 2018;32:fj201800547R.

Lamark T, Svenning S, Johansen T. Regulation of selective autophagy: the p62/SQSTM1 paradigm. Essays Biochem. 2017;61:609-24.

Zhao R, Yao F, Xiang C, Zhao J, Shang Z, Guo L, et al. Identification of NTRK gene fusions in lung adenocarcinomas in the Chinese population. J Pathol Clin Res. 2021;7:375-84.

Tan CT, Chang HC, Zhou Q, Yu C, Fu NY, Sabapathy K, et al. MOAP-1-mediated dissociation of p62/SQSTM1 bodies releases Keap1 and suppresses Nrf2 signaling. EMBO Rep. 2021;2:e50854.

Castruccio Castracani C, Longhitano L, Distefano A, Di Rosa M, Pittalà V, Lupo G, et al. Heme Oxygenase-1 and Carbon Monoxide Regulate Growth and Progression in Glioblastoma Cells. Mol Neurobiol. 2020;57:2436-46.

Liu Y, Liang Y, Zheng T, Yang G, Zhang X, Sun Z, et al. Inhibition of heme oxygenase-1 enhances anti-cancer effects of arsenic trioxide on glioma cells. J Neurooncol. 2011;104:449-58.