ÖZET
Amaç:
Kanserli hastaların vücut sıvılarında post-translasyonel histon modifikasyonlarının (PTHM) likit biyopsi bazlı ölçümü, biyobelirteç araştırmalarının yeni bir alanını temsil etmektedir. Bu çalışmada, perisentrik histone 4 lizin 20 trimetilasyonu (H4K20me3) ile ilgili dolaşımdaki DNA’yı çıkarmak ve ölçmek için enzime bağlı immünosorbent testini (ELISA) ve nicel polimeraz zincir reaksiyonu birleştiren bir yaklaşımın uygulanabilirliğini test ettik.
Gereç ve Yöntem:
ELISA kuyularına plazma eklendikten ve H4K20me3 ile ilgili nükleozomların antikora bağlanmasına izin verildikten sonra, NaHC03, SDS ve proteinaz K içeren bir tampon kullanılarak nükleozomal DNA bağışıklık komplekslerinden ayrıldı ve saflaştırıldı. Kolon kanseri ve kolon polipleri olan hastalardan H4K20me3 ile ilgili DNA’nın miktarını ölçmek için kromozom 16 ve 1’in perisentrik bölgelerinden tek kopya ve çoklu kopya dizisi çoğaltıldı.
Bulgular:
H4K20me3 ile ilişkili nükleozomal DNA’nın göreceli plazma seviyesi, kolon kanserli hastalarda kontrollere göre daha düşük görüldü ve chr16’ya özgü hedefte istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptandı (göreceli değerler sırasıyla 0,037’ye karşı 0,073 idi; p=0,008). H4K20me3 ile ilişkili nükleozomal DNA’nın kolon kanserinde düşük seviyelerde bulunması, diğer teknikler kullanılarak elde ettiğimiz önceki bulgularımızı doğrulamaktadır.
Sonuç:
Sonuç olarak, bulgularımız ELISA bağışıklık komplekslerinden proteine bağlı DNA’nın doğrudan çıkarılmasının uygulanabilirliğini göstermektedir ve PTHM’lerin veya diğer protein-DNA etkileşimlerinin değerlendirilmesinde farklı bir yöntem sağlayabilir.
GİRİŞ
Ökaryotik hücrelerde, nükleozomlar, kromatin içindeki DNA paketlemesinin temel fonksiyonel birimleridir. Her nükleozom, etraflarına sarılmış DNA ile dört çekirdek histondan (H3, H4, H2A ve H2B) oluşan bir oktamerden oluşur1. Kromatin bağlamında depolanan genetik bilgi, iki ana tip epigenetik modifikasyona, yani DNA metilasyonu ve çeşitli histon modifikasyonlarına tabidir. Nükleozomlardan çıkıntı yapan histon proteinlerinin N-terminal kuyruklarının post-translasyon modifikasyonları, kromatin yapısını etkiler, bu nedenle düzensizlikleri gen ekspresyonunu etkiler ve epigenetik, transkriptomik ve fenotipik değişikliklerin indüksiyonu yoluyla onkogeneze katkıda bulunan, insan kanserlerinde ortak bir mekanizmayı temsil eder2.
Üç seviyede (mono-, di- veya trimetilasyon) histon metiltransferazlar tarafından katalize edilen histon metilasyonu, esas olarak histon H3 ve H4’ün lizin kalıntıları üzerinde gerçekleşir ve gelişim ve farklılaşmada kilit rolleri olan dinamik bir süreçtir. Bu modifikasyonun sonuçları büyük ölçüde kontekste bağlıdır ve transkripsiyonel represyon veya aktivasyon ile ilişkilendirilebilir. H4K20’nin metilasyonu, metilasyon durumlarına bağlı olarak hem transkripsiyonel aktivasyon hem de represyon ile ilişkilidir. PR-Set7 tarafından katalize edilen H4K20me1, transkripsiyonel aktivasyon ile ilişkiliyken, SUV4-20H1/2 tarafından katalize edilen H4K20me2/3, perisentrik ve telomerik heterokromatini sürdürerek transkripsiyonun represyonu ile ilişkilidir3. H4K20me3 kaybı, kanserin ayırt edici özelliği olarak tanımlanmıştır4.
PTHM’lerde kansere bağlı değişikliklerin sıvı biyopsiye dayalı tespiti, grubumuz ve diğerleri tarafından bildirilmiştir5-9. Bu çalışmada amacımız, dolaşımdaki nükleozomal DNA’nın enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) kuyularında antijen-antikor komplekslerinden ekstraksiyonunun uygulanabilirliğini göstermekti. Bu, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) tahlillerine benzer, ancak burada iki yaklaşım arasında göreceli farklılıklar vardır. ChIP tahlillerinde, protein A/G agaroz boncuklar genellikle ilgili antikorları bağlamak için kullanılır ve bu genellikle DNA’nın veya hedef olmayan proteinlerin boncuklara non-spesifik bağlanmasıyla ilişkilendirilir10-12. Bu çalışmada kullanılan yaklaşımda, H4K20me3 ile ilişkili dolaşımdaki DNA’yı, test şeritleri üzerinde immobilize edilmiş anti-H4K20me3 antikorlarına bağlanan H4K20me3 içeren nükleozomlardan doğrudan çıkardık. Bu şekilde, birçok arka plan sinyali hariç tutulabilir. Ekstraksiyonun ardından, kolon kanseri veya kolon polipleri olan hastalardan alınan H4K20me3 ile ilgili dolaşımdaki DNA’yı ölçmek için kromozom 16 ve 1’in perisentrik bölgelerinden tek bir kopya ve çoklu kopya dizisi amplifiye edildi.
GEREÇ VE YÖNTEM
Çalışma Katılımcıları
Çalışma kohortu, İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi Hastanesi Cerrahi Kliniği’nde kolonoskopi işlemi uygulanan bireyleri içermektedir. Kolonda patolojik olarak doğrulanmış polipleri olan bireyler (kontrol grubu, n=15) ve patolojik olarak doğrulanmış kolon kanseri olanlar (kanser grubu, n=15) çalışmaya alındı. Kolon kanserli hastaların özellikleri Tablo 1’de gösterilmiştir. Çalışma İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi Etik Kurulu tarafından onaylandı (onay no: 2018/1095) ve her katılımcıdan bilgilendirilmiş onam alındı. Yazılı bilgilendirilmiş onam formları her hasta tarafından okundu ve operasyon öncesi imzalı onayları alındı.
Dolaşan Nükleozomların Kantifikasyonu
Kolonoskopi prosedüründen önce kan örnekleri EDTA tüplerine alındı ve plazma fraksiyonu elde etmek için hemen santrifüjlendi (717 x g’de 10 dakika). Yeniden santrifüjden sonra plazma, tahlil edilene kadar -80 °C’de alikuotlarda saklandı. Dolaşımdaki nükleozomların plazma seviyeleri, daha önce bildirildiği gibi, Cell-Death Detection ELISA kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Almanya) kullanılarak belirlendi6. İki kez 20 μL plazma uyguladık ve optik yoğunlukta ölçülen ortalama sinyal değerleri, rölatif plazma konsantrasyonları olarak kabul edildi.
ELISA’da Antikora Bağlı Nükleozomlardan H4k20me3 ile İlgili Nükleozomal DNA Ekstraksiyonu
H4K20me3’ün ELISA benzeri ölçümlerini sağlayan, ticari olarak satılan EpiQuik Global Tri-Methyl Histone Quantification Kit (Epigentek, Farmingdale, NY, ABD) kullanıldı. Ancak nükleozomal DNA, H4K20me3 ölçümü tamamlanmadan önce antikora bağlı nükleozomlardan ekstrakte edildi. Bunun için ELISA kuyucuklarına 50 µL plazma ilave edildi ve H4K20me3 ile ilgili nükleozomların 1 saat boyunca antikora bağlanmasına izin verildi. Birkaç yıkama aşamasından sonra, bağlı DNA aşağıdaki gibi ekstrakte edildi: ekstraksiyon tamponu [100 mM NaHC03, %1 SDS ve proteinaz K (250 µg/mL)] H4K20me3-antikor kompleksleri üzerine ilave edildi ve nükleozomal DNA’nın immün komplekslerinden ayrılmasına yol açarak, 15 dakika boyunca 65 °C’de inkübe edildi. Ayrılan DNA, tüplere aktarıldı, 100 uL’ye seyreltildi ve spin kolonları kullanılarak saflaştırıldı. DNA, 50 uL elüsyon tamponunda ayrıştırıldı ve saflık kontrol edildikten sonra -20 °C’de saklandı.
Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile Nükleozomal DNA’nın Kantitasyonu
H4K20me3 perisentrik heterokromatin açısından zengin olduğundan, kromozom 1 ve 16’nın perisentrik bölgelerinden iki genomik diziyi amplifiye ettik. chr16 için primerler, tek bir kopya dizisinin amplifikasyonuna izin verir ve şu dizilere sahiptir: 5’AATCCAATGGAATCATCGAGT-3’ ve 5’-GGTGATTTCATTCAAGTCCATTC-3’.
chr1 için primerler en az 40 kopya amplifiye eder ve bunlar 5’-GGTTCCATTTGATGATGATTCC-3’ ve 5’-ATCGAGTGGAATCGAATGG-3’ idi. İnsan genomunun tüm genomik bölgelerinde bulunan ve sentromerlere yakın zenginleştirilmiş LINE1 elementi, hedef dizileri normalleştirmek için referans dizi olarak kullanılmıştır. 148-bp amplikon ile sonuçlanan LINE1 primer dizileri 5’-AAAGCCGCTCAACTACATGG-3’ ve 5’-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3’ idi. Gerçek zamanlı PZR, talimatlara göre floresan molekülü olarak SYBR green ile bir light-cycler 480’de gerçekleştirildi. Reaksiyonlar çift olarak gerçekleştirildi ve ∆∆Ct yöntemi kullanılarak perisentrik dizilerin rölatif konsantrasyonları hesaplandı.
İstatistiksel Analiz
Çalışma bulguları medyan, çeyrekler ve toplam aralıklar olarak sunulmuştur. Çalışma grupları arasındaki ayrım Mann-Whitney U testi kullanılarak yapıldı. <0,05 olan p-değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Hesaplamalar SPSS 21.0 istatistik yazılımı (IBM Corporation, Armonk, NY, ABD) kullanılarak yapıldı.
BULGULAR VE TARTIŞMA
Kolon kanserli hastalardan ve kontrollerden alınan tüm plazma numuneleri, kanser grubunda biraz daha yüksek seviyelerle birlikte dolaşımdaki nükleozom seviyelerine sahipti (Şekil 1A). H4K20me3-ELISA immün komplekslerinden nükleozomal DNA’nın ekstraksiyonunun ardından, DNA tüm numunelerde mevcuttu ve Chr 1 ve 16’dan perisentrik dizilerin amplifikasyonu için bir şablon olarak kullanıldı. H4K20me3 ile ilişkili nükleozomal DNA’nın rölatif plazma seviyesi, her iki hedef dizi için de kolon kanserli hastalarda kontrollere göre daha düşüktü (Şekil 1B ve 1C). Chr1’e özgü hedefte, H4K20me3 ile ilişkili nükleozomal DNA’nın rölatif değerleri kolon kanserli hastalarda ve polipli hastalarda sırasıyla 2,74 ve 3,2 (p=0,16) idi. chr16’ya özgü perisentrik bölgede, kolon kanserli hastalar ile kontroller arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıydı (rölatif değerler: Sırasıyla 0,037 ve 0,073; p=0,008). Bu bulgular, H4K20me3 ile ilişkili dolaşımdaki nükleozomal DNA’nın, premalign duruma kıyasla kolon kanserinde düşük seviyelerde bulunduğunu göstermektedir ve ChIP veya ELISA benzeri yaklaşımlar kullanıldığında önceki bulgularımızı doğrulamaktadır5,6. Çalışmadaki hasta sayısı çok az olsa bile, daha ileri hastalığı olan hastalarda (n=7) lokalize hastalığı olanlara göre her iki hedef sekans düzeyi daha düşüktü (n=8) (Chr1’e özgü hedef için 2,26’ya karşı 3,4 ve Chr16’ya özgü hedef için 0,036’ya karşı 0,049). Genel olarak, H4K20me3 ile ilişkili nükleozomal DNA’nın azalmış plazma seviyelerinin, kanserin ayırt edici özelliği olarak tanımlanan kolon tümörlerindeki H4K20me3 kaybının bir yansıması olması muhtemeldir4,13.
Bildiğimiz kadarıyla bu, dolaşımdaki nükleozomal DNA’nın ELISA immün komplekslerinden çıkarılmasının uygulanabilirliğini tanımlayan ilk rapordur. Çalışmamız bu yaklaşımın ChIP ile doğrudan bir karşılaştırmasını içermese de, ChIP deneylerinde kullanılan protein A/G agaroz boncukları DNA ve hedef olmayan proteinleri non-spesifik bir şekilde bağladığı için bu yöntem arka plan gürültü sinyallerini önlemede ChIP’den daha üstün olabilir10-12.
Hastalığı olan bireylerin vücut sıvılarındaki PTHM değişikliklerinin incelenmesi, nispeten yeni bir araştırma alanını temsil etmektedir. Kanserin ana konu olduğu, dolaşımdaki nükleozomlarda PTHM’lerin ölçümü için, ChIP, ELISA benzeri ölçüm veya daha yakın zamanda kütle spektrometrisi gibi farklı teknikler kullanılmıştır5-9. Şimdiye kadar yapılan araştırmalar, PTHM’lerin vekil kanser biyobelirteçleri olarak sıvı biyopsiye dayalı tespit potansiyelini ortaya çıkardı. Bununla birlikte, PTHM’lerin sayısı ve düzenlenmesindeki karmaşıklık, pre-analitiklerin standardizasyonunun olmaması ve bunların ölçüm yöntemi göz önüne alındığında, valide edilmiş belirteçlerin klinik kullanım için uygun hale gelmesinden önce önemli araştırmalar gereklidir.
Çalışmanın Kısıtlılıkları
Çalışmamızın kısıtlılığı hasta sayımızın az olmasıdır. Daha fazla hasta sayısı ile yapılacak başka çalışmalara ihtiyaç vardır.
SONUÇ
Kandaki veya diğer biyolojik sıvılardaki biyobelirteçlerin tespiti, minimal invaziv olmaları ve kolay erişilebilir olmaları gibi birçok avantaj sunar. Burada, protein-DNA etkileşimlerinin analizi için basitleştirilmiş bir yöntemi temsil eden ve sıvı biyopsi ölçümlerinde PTHM’lerin değerlendirilmesinde ek bir yol sağlayabilen ELISA immün komplekslerinden nükleozomal DNA’nın doğrudan ekstraksiyonunun uygulanabilirliğini gösteriyoruz.
