ÖZET

Amaç:

Koroner arter hastalığı (KAH), epikardiyal arterlerde aterosklerotik plak birikimi ile karakterize patolojik bir süreçtir. Enflamasyon ve yüksek lipid düzeyleri aterosklerozdaki patolojik değişikliklerde rol oynar. Geleneksel risk faktörlerinin yanı sıra, tek nükleotid polimorfizmi (SNP’ler) gibi genetik faktörler de hastalık sürecine dahil olabilir. Bu çalışmada koroner arter bypass greft (KABG) uygulanan hastalarda okside düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü 1 (OLR1) 3’UTR188C>T gen polimorfizmi, C-reaktif protein (CRP) ve lipid durumunun etkilerini değerlendirmeyi amaçladık.

Gereç ve Yöntem:

Çalışma popülasyonunu KABG geçirmiş 109 KAH hastası ve 127 sağlıklı kontrol oluşturdu. OLR1 3’UTR188C>T polimorfizmi, PCR-RFLP tekniği kullanılarak genotiplendi. Otomatik biyokimya analizörü ile serum CRP, yüksek yoğunluklu lipoprotein-kolesterol (HDL-K) ve düşük yoğunluklu lipoprotein-kolesterol (LDL-K) seviyeleri ölçüldü.

Bulgular:

OLR1 3’UTR188C>T genotiplerinin ve alellerinin dağılımı, KABG’li KAH hastaları ve kontroller arasında anlamlı farklılık göstermedi. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında hastalarda serum CRP seviyeleri yüksekti (p<0,001), ancak HDL-K ve LDL-K seviyeleri iki grup arasında farklı değildi. Sigara kullanımı, alkol kullanımı, aile öyküsü, diabetes mellitus ve hipertansiyon gibi geleneksel risk faktörleri hastalarda kontrol grubuyla karşılaştırıldığında yüksekti (her biri için p<0,001). CRP seviyeleri, TT, CT ve CC genotiplerine sahip hastalarda aynı genotiplere sahip kontrollere göre daha yüksekti (sırasıyla p<0,001, p<0,01 ve p<0,05).

Sonuç:

OLR1 3’UTR 188C>T polimorfizmi, ateroskleroz duyarlılığında yer almayabilir. Ancak sigara, alkol tüketimi, aile öyküsü, hipertansiyon, diabetes mellitus ve dolaşımdaki CRP seviyeleri gibi aterosklerozdaki geleneksel risk faktörleri KABG popülasyonumuzda artmıştır. OLR1 3’UTR188C>T ve farklı OLR1 SNP’lerin değerlendirilmesi, aterosklerozdaki tek ve birleşik etkileri açısından yararlı olabilir.

GİRİŞ

Koroner arter bypass grefti (KABG), aterosklerotik plak tarafından kısmen veya tamamen tıkanmış olan koroner arterleri bypass etmek için damarların greft olarak kullanıldığı cerrahi bir prosedürdür¹. Ateroskleroz, arterlerde lipitlerin, fibröz elementlerin birikmesi ve kalsifikasyonla karakterize bir hastalıktır. Bu süreç endotelin aktivasyonu ile başlamakta ve ardından enflamatuvar yanıtın aktivasyonu ile ortaya çıkan bir dizi olay vazokonstriksiyona ve aterom plağı oluşumuna yol açmaktadır².

Birçok çalışma aterosklerozun biyolojik ve genetik temelini açıklamaya çalışmıştır^3-6. Deneysel çalışmalar aterosklerozun patofizyolojisinin aydınlatılmasına yardımcı olmasına rağmen klinik boşluklar devam etmektedir⁵. Ateroskleroz gibi kronik hastalıklarda rol oynayan genetik faktörleri incelemek için kullanılan çeşitli yöntemler, hastalığın gelişimindeki genetik temele odaklanmıştır. Ancak ateroskleroz gibi çoğu kronik hastalıkta hastalıkların gelişimini belirlemek için çeşitli çevresel faktörlerin etkisi altında birden fazla etki eden gen araştırılmıştır. Bu genlerin tanımlanması aday gen yaklaşımını takip etmiştir. Lipid mobilizasyonunda yer alan ateroskleroz genlerinin patogenezinin anlaşılmasına dayanarak, örneğin enflamasyon ve endotel fonksiyonu ile ilişki, aterom veya kardiyovasküler olayların varlığı incelenmiştir⁷. Koroner arter hastalığı (KAH) süreciyle ilişkili genlerin üç kategoriye ayrılabileceği rapor edilmiştir: hastalığa neden olan genler, duyarlılık genleri ve hastalıkla ilişkili genler^8,9.

Oksitlenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü 1’i (OLR1) kodlayan insan geni, 12p13.1-p12.3 kromozomuyla eşleşmekte ve 5 intron tarafından kesintiye uğrayan 6 eksondan oluşmaktadır. OLR1 geni, sıklıkla kardiyovasküler bozukluklarla ilişkili kromozomal bölgedeki konumu ve ürününün lipid metabolizma yollarındaki biyokimyasal rolü nedeniyle kardiyovasküler hastalık için iyi bir aday gendir^10,11. Altı kodlamayan tek nükleotid polimorfizmi (SNP) OLR1’in 3’-terminal kısmındaki ekson 5’in alternatif eklenmesinde ve OLR1’in ekson 5’inden yoksun LOXIN transkript varyantının ekspresyonunda rol oynadığı rapor edilmiştir. 3’UTR (188C>T), intron 5 (IVS5-27G>T ve IVS5-70A>G) ve intron 4 (IVS4-14A>G, IVS4+27G>C, IVS4-73C>T) dahil olmak üzere bu 6 kodlamayan polimorfizm, haplotip blok bölgesinde yer almakta ve LOXIN ekspresyonunu değiştirerek KAH gelişme riskini etkilemektedir^12,13. Çalışmalar OLR1’in ateroskleroz ve tromboz patofizyolojisinde önemli bir rol oynayabileceğini bildirmiştir^13,14. OLR1 geninin 3’-UTR’sindeki bir polimorfizm olan 188C>T’nin KAH ile ilişkili olduğu bulunmuştur^13,15 ancak bu polimorfizmin damar hastalıklarıyla ilişkili olmadığını bildiren çalışmalar da mevcuttur^16-18. Ayrıca proenflamatuvar etkilere sahip olan C-reaktif proteinin (CRP) vasküler hücreler üzerinde proaterojenik ve protrombotik etkiler göstererek KAH patogenezinde rol oynayabileceği de rapor edilmiştir¹⁹. Bu bilgileri dikkate alarak Türk toplumunda KABG uygulanan hastalarda OLR1 188C>T polimorfizmi ile serum CRP ve lipid düzeylerini araştırmayı amaçladık.

GEREÇ VE YÖNTEM

Olgular

Bu prospektif olgu-kontrol çalışmasına KABG ameliyatı geçirmiş 109 hasta (30 kadın ve 79 erkek) ve 127 sağlıklı kontrol (47 kadın ve 80 erkek) dahil edildi. Hastaların ve kontrollerin ortanca yaşı sırasıyla 58 ve 50 idi. Kontrol grubu olarak herhangi bir kardiyovasküler olay öyküsü olmayan ve herhangi bir KAH semptomu olmayan sağlıklı kişiler dahil edildi. Dışlama kriterleri arasında kanser, otoimmün, böbrek veya karaciğer hastalığı yer alıyordu. Tüm katılımcılar Türk kökenliydi ve örnek ve veri toplanmadan önce imzalı bilgilendirilmiş onam alındı. Bu çalışma Sağlık Bilimleri Üniversitesi, İstanbul Eğitim ve Araştırma Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylandı (no: 162, onay tarihi: 20.05.2022). Tüm prosedürler, insan deneylerinden sorumlu komitenin (kurumsal ve ulusal) ve/veya 1964 Helsinki Bildirgesi’nin ve sonraki versiyonlarının etik standartlarına uygun olarak gerçekleştirildi.

Kan Örnekleri

Kan örnekleri, bir gecelik açlığın ardından etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren iki tüpe alındı. EDTA içeren kan tüplerinden biri genotip analizi için kullanıldı ve analize kadar -80 °C’de saklandı. Diğer tüp ise 400 x g’de 4 °C’de 10 dakika santrifüj edildikten sonra plazma örnekleri eppendorf tüplere ayrıldı ve analize kadar -20 °C’de bekletildi.

Biyokimyasal Analizler

CRP’nin plazma konsantrasyonları, Dade Behring kitleri (BN II Sistem Analizörü Dade Behring, Almanya) kullanılarak nefelometrik immünolojik analiz ile belirlendi. Ayrıca plazma yüksek yoğunluklu lipoprotein-kolesterol (HDL-K) ve düşük yoğunluklu lipoprotein-kolesterol (LDL-K) seviyeleri, ticari kitler (Cobas 8000, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Almanya) kullanılarak otomatik kolorimetrik yöntemlerle ölçüldü.

DNA İzolasyonu ve Genotipleme

DNA izolasyonu için kan EDTA içeren tüplere alındı. Üreticinin talimatlarına uygun olarak periferik kan lökositlerinden DNA ekstrakte etmek için Roche DNA saflaştırma kiti (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Almanya) kullanıldı. İzole edilen DNA örnekleri -80 °C’de dondurularak saklandı. ORL1 188C>T polimorfizmi, standart polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) prosedürleri ve restriksiyon enzimi kullanılarak genotiplendi. Kullanılan iki primer çifti vardı: F: 5’-TGTCAACATTTTTGATTCTAGCTA-3’ ve R: 5’-GTTTCTCCATGTTCTGTCTTTCA-3’ idi. PCR karışımı (20 μL toplam hacim), 25 ng gDNA, her primerden 10 pmol/μLl ve her bir dNTP’den 2,5 mM, 2,5 U i-Taq^TM DNA polimeraz, 1 x PCR reaksiyon tamponu ve 1 x jel yükleme tamponu içeren 2 x PCR MasterMix çözeltisinden (intron Bioteknoloji, Kore) oluşuyordu. PCR’yi gerçekleştirmek için bir Techne Thermal Cycler (Applied Biosystems Gene Amp PCR System 9700, Singapur) kullanıldı. PCR koşulları sırasıyla: 94 °C’de 2 dakika süreyle başlangıç denatürasyonu, ardından 94 °C’de 20 saniye süreyle 40 döngü denatürasyon, 51 °C’de 10 saniye süreyle tavlama ve 72 °C’de 30 saniye süreyle uzama basamağını içermekteydi. Nihai amplikon uzatması 72 °C’de 5 dakika süreyle gerçekleştirildi. PCR amplikonları %2 agaroz jelde elektroforez ile ayrıldı ve etidyum bromür boyama ile görselleştirildi. 188C>T PCR ürünü 207 bp idi. Amplifiye edilen PCR ürünleri, KpnI (Invitrogen Life Tecnologies Corporation, Carlsbad, CA, ABD) restriksiyon enzimi (10 ünite/μL) ile 37 °C’de gece boyunca inkübe edildi. KpnI uygulamasından sonra iki fragman elde edildi: C aleli için 184 ve 23 bp ve T aleli için 207 bp’lik tek bir fragman. Sindirilen DNA’lar 1 x Tris borat EDTA tamponu içerisinde %3 agaroz jel üzerinde ayrıldı ve ardından etidyum bromür çözeltisi ile boyandı. 188C>T genotipleri Polaroid kamera kullanılarak tespit edildi ve ultraviyole ışık altında görüntülendi.

İstatistiksel Analiz

Hasta ve kontrol değerlerinin analizinde Statistical Package for the Social Sciences statistic 21.0 programı kullanıldı. Hardy-Weinberg dengesi ki-kare testiyle analiz edildi. Genotip ve alel frekansları olgular ve kontroller arasında ki-kare analizi ile karşılaştırıldı. Olasılık oranı ve %95 güven aralığı kullanılarak alelik ve genotip dağılımları arasındaki etkiler değerlendirildi. Diğer parametrelerin karşılaştırılmasında eşleştirilmemiş Student’s t-testi (normal dağılan değişkenler) veya Mann-Whitney U testi (normal dağılmayan değişkenler) kullanıldı. P<0,05 değeri minimum istatistiksel anlamlılık olarak kabul edildi.

BULGULAR

KABG uygulanan hastaların ve kontrol grubunun özellikleri Tablo 1’de özetlendi. Hasta ve kontrol grubu arasında yaş, cinsiyet, vücut kitle indeksi (VKİ), HDL-K, LDL-K ve sistolik kan basıncı açısından anlamlı fark yoktu (p>0,05). Hastalarda kontrol grubuyla karşılaştırıldığında sigara, alkol kullanımı, aile öyküsü, diyabet, CRP, hipertansiyon ve diyastolik kan basıncı artmıştı (sırasıyla, p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001 ve p<0,05).

OLR1 3’-UTR 188C>T gen polimorfizmini incelendi, KABG hastaları ve kontrol gruplarındaki genotiplerin frekansları Tablo 2’de verildi. TT, CT ve CC genotiplerinin dağılımı olgularda sırasıyla %53,21, %26,60 ve %20,18, kontrollerde ise sırasıyla %46,45, %33,85 ve %19,69 idi. İki grup arasında gen polimorfizmi açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmedi (p>0.05). Ayrıca T ve C alellerinin dağılımı olgularda sırasıyla %66,51 ve %33,48, kontrollerde ise sırasıyla %63,38 ve %36,61 idi (p>0,05) (Tablo 2).

OLR1 3’-UTR 188C>T gen polimorfizminin VKİ, CRP, HDL-K, LDL-K ile kan basıncı ve kan basıncı düzeyleri üzerinde herhangi bir etkisinin olup olmadığını değerlendirmek için bu parametreleri hasta ve kontrollerdeki genotip grupları arasında karşılaştırıldı (Tablo 3). TT, CT ve CC genotipli hastalarda CRP düzeyleri aynı genotipli kontrollere göre daha yüksekti (sırasıyla p<0,001, p<0,01 ve p<0,05). Ayrıca CC genotipli hastalarda sistolik kan basıncı düzeyleri aynı genotipli kontrollere göre daha yüksekti (p<0,05). TT genotipli hastalarda diyastolik kan basıncı düzeyleri aynı genotipli kontrollere göre daha yüksekti (p<0,05). Hasta ve kontrol grupları arasında aynı genotipin diğer parametreleri karşılaştırıldığında anlamlı bir fark saptanmadı.

TARTIŞMA

OLR1 olarak da adlandırılan lektin benzeri oksitlenmiş LDL reseptörünü kodlayan insan geninin, kardiyovasküler hastalıklar için iyi bir aday olduğu ve kardiyovasküler bozukluklarla ilişkili bir kromozomal bölgede yer aldığı rapor edilmiştir¹⁰. Ayrıca OLR1 genindeki SNP’ler de araştırılmıştır. KAH gelişme riski ile ilişkili olduğu bildirilmektedir¹². OLR1 3’ UTR 188C>T polimorfizmi, regülatör bağlanma bölgesini değiştirerek ve dolayısıyla protein homeostazisini değiştirerek LOX-1 ekspresyonunu etkileyebilir²⁰. Bu nedenle çalışmamızda KABG uygulanan hastalarda OLR1 3’ UTR 188C>T polimorfizmi araştırıldı, ayrıca CRP, lipid ve kan basıncı düzeyleri aynı genotip dağılımlarında değerlendirildi.

Literatürde damar hastalıklarında OLR1 188C>T polimorfizmini araştıran çalışmalarda çelişkili bulgular rapor edilmiştir^{13,15,16,18,21}. Mango ve ark.¹³ İtalyan popülasyonunda akut miyokard enfarktüsü geçiren hastalarda 3’ UTR 188C>T polimorfizmini incelemiş, hasta ve kontrol grupları arasında anlamlı değişiklik olduğunu, T aleli taşıyıcılığının kardiyovasküler olay riskini artırdığını bildirmişlerdir. Benzer şekilde Guo ve ark.²¹ 188C>T polimorfizminde T alelinin sıklığının, Çin popülasyonundaki sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında aterosklerotik serebral enfarktüslü hastalarda anlamlı derecede yüksek olduğunu gözlemlemişlerdir²¹. Novelli ve ark.¹⁵ 3’UTR 188C>T SNP’nin miyokard enfarktüsü ile ilişkisini doğrulamışlardır (p<0,003). Cheng ve ark.²² 3’UTR 188C>T’nin KAH duyarlılığını arttırdığına dair 8 çalışmayı içeren bir meta-analiz bildirmişlerdir. On bir araştırmanın bulgularını içeren bir başka meta-analiz çalışmasında 188C>T polimorfizmindeki varyant genotipinin KAH riskinin artmasıyla ilişkili olduğu öne sürülmüştür²³.

Ancak damar hastalıklarında OLR1 3’UTR 188C>T polimorfizminde değişiklik bulunmadığını bildiren çalışmalar da mevcuttur. Liu ve ark.²⁴ Kuzey Çin Han popülasyonunda LOX-1 gen polimorfizmi, 3’UTR 188C>T ile serebral enfarktüs arasındaki ilişkiyi araştırmışlardır. Ancak 3’UTR 188C>T ile serebral enfarktüs riski arasında bir ilişki bulunmadığını bildirmişlerdir. Sentinelli ve ark.¹⁶ İtalyan popülasyonunda KAH ve kontroller arasında OLR1 geninin alel frekanslarında anlamlı bir fark olmadığını ve 3’ UTR 188C>T polimorfizminin çalışılan popülasyonda KAH patogenezinde rol oynama ihtimalinin düşük olduğunu bildirmişlerdir. Benzer şekilde Trabetti ve ark.¹⁷ İtalyan popülasyonunda KAH’taki 3’UTR SNP’lerin alel veya genotip dağılımında, KAH olmayan deneklerle karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulamamışlardır. Kurnaz ve ark.¹⁸ Türk toplumunda 3’UTR 188C>T SNP ile KAH varlığı arasında korelasyon görülmediğini, genotip grupları arasında karşılaştırma analizinde ve kardiyovasküler risk faktörlerinin ortalama değerlerinde farklılık olmadığını bildirmişlerdir. Tripathi ve ark.²⁵ Kuzey Hindistan popülasyonundaki 3’UTR 188C>T polimorfizminin KAH hastaları ile sağlıklı kontroller arasında anlamlı bir fark göstermediğini bildirmiştir.

Çalışmamızın bulguları değerlendirildiğinde, KABG hastaları ile sağlıklı gönüllüler arasında OLR1 3’UTR 188C>T genotipi ve alel dağılımlarında anlamlı bir değişiklik olmadığı görüldü. Literatürde 3’UTR 188C>T polimorfizmi ile ilgili olarak bildirilen çelişkili bulgular, çalışma popülasyonlarının sınırlı olmasından, polimorfizmlerin etnik çeşitliliğinden ve karmaşık çevresel faktörlerden kaynaklanıyor olabilir.

KAH gelişiminde genetik faktörlerin yanı sıra sigara içme, fiziksel hareketsizlik, aşırı kilo, kontrolsüz stres, sağlıksız beslenme gibi değiştirilebilir faktörler ile ileri yaş, erkek cinsiyet, ırk gibi değiştirilemeyen faktörler de etkilidir. Epidemiyolojik çalışmalar, yüksek kolesterol düzeyi, hipertansiyon ve diyabet gibi risk faktörlerinin de ateroskleroz gelişiminde rol oynadığını bildirmektedir²⁶. Aterojenezin, oksitlenmiş düşük yoğunluklu lipoproteinlerin (OxLDL’ler) yüksek plazma ve doku seviyeleri tarafından desteklendiği bilinmektedir. Ox-LDL’ler proenflamatuvar genlerin ekspresyonunu artırarak damar duvarına monosit toplanmasına ve vasküler endotelyal hücrelerin fonksiyon bozukluğuna yol açmaktadır. Ox-LDL’ler makrofajları aterosklerotik plaklar oluşturan köpük hücrelerine dönüştürülmektedir²⁷.

Stancel ve ark.¹⁹ CRP ve LOX-1’in aterogenezde ox-LDL ile siklik bir mekanizma oluşturduğunu ileri sürmüştür. CRP, öncelikle hepatositler tarafından sentezlenen bir akut faz proteinidir. CRP’nin aterosklerozun enflamatuvar bileşenini teşvik etmede doğrudan rol oynayabileceği rapor edilmiştir. Ek olarak, plak dokularında CRP seviyelerinde bir artış tespit edilmiştir². CRP, OLR1 için bir liganttır, vasküler geçirgenliği arttırır, endotel bağımlı vazodilatör fonksiyonunu bozar ve monosit-endotel hücre adezyonunda rol oynamaktadır^19,27.

Çalışmamızın bulguları değerlendirildiğinde KABG grubunda kontrole göre sigara, alkol tüketimi, aile öyküsü, hipertansiyon, diyabet ve CRP düzeylerinin arttığı görüldü (Tablo 1). Bu veriler aterogenez gelişimini etkileyen risk faktörlerine ilişkin bulgularla uyumludur. Aynı genotipin hasta ve kontrol gruplarında VKİ, HDL-K, LDL-K, CRP, sistolik kan basıncı ve diyastolik kan basıncı üzerine etkisini de araştırdık. Her 3 genotipte CRP değerleri kontrol grubuna göre artmıştı, ayrıca hasta grubunda CC genotipinde sistolik kan basıncı değeri, TT genotipinde diyastolik kan basıncı değeri kontrol grubuna göre daha düşüktü (Tablo 3).

Diğer birçok enflamatuvar medyatörden farklı olarak CRP, günlük dalgalanmalara veya biyolojik değişikliklere tabi değildir. Bu nedenle CRP konsantrasyonu hastalığın şiddeti ile orantılı görünmektedir. Bununla birlikte, CRP’nin ana sınırlaması, sistemik enflamasyonun artmasıdır ve bu da postoperatif hastalarda prognostik bir belirteç olarak kullanımını sınırlayabilir²⁸. Hasta grubumuzdaki CRP değerlerindeki artışın KABG operasyonuna bağlı olabileceği düşünülmektedir.

Çalışmanın Kısıtlılıkları

Çalışmamızın örneklem büyüklüğünün küçük olması ve tek merkezli bir çalışma olması, analizlerimizin istatistiksel gücünü etkilemiş olabilir.

SONUÇ

Sonuç olarak, çalışmanın verileri, Türk örneklemimiz için OLR1 3’UTR 188C>T polimorfizminin ateroskleroza yatkınlıkta rol oynamayabileceğini göstermektedir. Ancak sigara, alkol tüketimi, aile öyküsü, hipertansiyon, diyabet ve dolaşımdaki CRP seviyeleri gibi aterosklerozdaki geleneksel risk faktörleri KABG popülasyonumuzda artmıştır. OLR1 3’UTR188C>T ve farklı OLR1 SNP’lerin ateroskleroz riski ile ilgili tek ve kombine etkileri değerlendirilmesi faydalı olabilir.