Sıçanlarda Karbon Tetraklorür ile Oluşturulan Testis Hasarına Karşı Kafeik Asit Fenetil Esterin Koruyucu Etkileri: Histolojik Çalışma

Belemir GÜLHAN; Elif TAŞLIDERE; Nigar VARDI; Aslı TAŞLIDERE; Hülya ELBE

doi:10.4274/nkmj.galenos.2023.82474

ÖZET

Amaç:

Karbon tetraklorür (CCI₄) birçok dokuda hasara yol açabilen, uçucu organik bir kimyasal ajandır. Yapıca flavonoidlere benzeyen kafeik asit fenetil ester (CAPE), bal arısı propolisinin aktif bir bileşenidir. CAPE’nin antitoksik, antioksidan, anti-enflamatuvar etkileri olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada CCI₄’ün neden olduğu testis hasarına karşı CAPE’in etkilerini incelemeyi amaçladık.

Gereç ve Yöntem:

Yirmi sekiz adet Wistar-albino sıçan 4 gruba ayrıldı (n=7). Grup 1: Kontrol (%5 etanol, 1 mL/gün/ip), Grup 2: Zeytinyağı (0,5 mL/gün aşırı/ip), Grup 3: CCI₄ (0,5 mL/kg gün aşırı/ip), Grup 4: CCI₄+CAPE (10 μmol/kg/gün/ip). Deney sonunda alınan doku örnekleri %10’luk formaldehitte tespit edilerek parafine gömüldü. Parafin bloklardan alınan 5 μm kalınlığındaki kesitler hematoksilen-eozin ile boyandı. Testiküler hasarı değerlendirmek için ışık mikroskobunda her kesitten x20 büyütmede rastgele 100 tübül incelenerek sağlam, atrofik ve dejenere tübüller olarak sınıflandırıldı. Kesitler, Leica DFC 280 ışık mikroskobu ve Leica Q Win Görüntü Analiz sistemi (Leica Micros Imaging Solutions Ltd. Cambridge, UK) kullanılarak incelendi.

Bulgular:

Kontrol ve zeytinyağı gruplarına ait testis kesitleri normal histolojik görünümdeydi. CCI₄ grubunda seminifer tubullerin %55,00±4,22’si sağlam, %25,00±2,67’si atrofik ve %20,00±1,88’i dejeneratif olarak gözlendi. Ayrıca, bazı seminer tübüllerin lümeninde multinükleer dev hücrelere rastlandı. CCI₄+CAPE grubunda ise tübüllerin %72,14±3,91’i sağlam, %16,42±2,10’u atrofik ve %11,42±2,36’sı dejeneratifti. CCI₄ grubunda etkilenen tübüllerin sayısı kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde artarken (p<0,05), CCI₄+CAPE grubunda etkilenen seminifer tübüllerin sayısının, CCI₄ grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde azaldığı tespit edildi (p<0,05).

Sonuç:

CAPE’nin, CCI₄’ün testis üzerindeki hasar verici etkilerinin azaltılmasında faydalı olabileceğini düşünmekteyiz.

Anahtar Kelimeler:

CAPE, karbon tetraklorür, sıçan, testis

GEREÇ VE YÖNTEM

Deney Hayvanları

Çalışmamızda kullanılan 200-250 g olan 3 aylık 28 adet Wistar albino erkek sıçanlar, İnönü Üniversitesi Deney Hayvanları Üretim ve Araştırma Merkezi’nden temin edildi. Çalışmamız için İnönü Üniversitesi Deney Hayvanları Etik Kurulu’ndan onay alınmıştır (protokol no: 2012/A-49, tarih: 21.03.2012). Sıçanlar oda sıcaklığı 24-27 ºC arasında, havalandırma şartları sağlanmış, aydınlatılması 12 saat aydınlık 12 saat karanlık olacak şekilde ayarlanan odalarda barındırıldı. Sıçanlar çalışma boyunca ad libitum standart pellet yemle beslendi. Rastgele seçilen denekler 4 farklı gruba ayrıldı.

Deney Grupları

Grup 1: Kontrol, Grup 2: Zeytinyağı, Grup 3: CCI₄, Grup 4: CCI₄+CAPE.

1. Kontrol grubu: Bu gruptaki sıçanlara 10 gün süreyle, 1 mL/gün %5 etanol intraperitoneal olarak uygulandı.

2. Zeytinyağı grubu: Bu gruptaki sıçanlara 10 gün süreyle 0,5 mL/gün aşırı zeytinyağı intraperitoneal olarak uygulandı.

3. CCI₄ grubu: Bu gruptaki sıçanlara 10 gün süreyle 0,5 mL/kg gün aşırı CCI₄intraperitoneal yolla uygulandı.

4. CCI₄+CAPE grubu: Bu gruptaki sıçanlara 10 gün süreyle zeytinyağında çözülerek hazırlanan 0,5 mL/kg gün aşırı CCI₄ve ardından 10 µmol/kg CAPE etanolde çözülerek intraperitoneal yolla uygulandı.

Çalışmanın 11. gününde sıçanlara 5 mg/kg xylazine ile 50 mg/kg ketamin i.p uygulanarak genel anestezi altında orta hat insizyonuyla batınları açıldı. Histolojik incelemeler için testis doku örnekleri alındı.

Histolojik Analizler

Histopatolojik değerlendirme için dokuların tespit ve takip işlemlerine geçildi. Dokunun iyi fikse olması için %10’luk formaldehite konuldu. Örnekler, daha sonra 34 mm’lik daha küçük parçalara ayrılıp plastik doku takip kasetlerine konularak formaldehitte 24 saat süre ile fikse edildi. Fiksasyon işleminin bitmesini takiben parçalar 24 saat boyunca akan çeşme suyunda yıkandılar. Daha sonra dereceli alkollerde dehidrate edilerek, ksilende şeffaflaştırılıp parafine gömüldüler. Parafin bloklardan Leica RM2145 marka mikrotom yardımıyla 5’er mikron’luk kesitler alındı. Kesitlere genel histolojik yapıyı gözlemlemek amacıyla Hematoksilen ve eozin, boyama yöntemi uygulandı. Testiküler hasarı değerlendirmek için ışık mikroskobunda her kesitten x20 büyütmede rastgele 100 tübül incelenerek sağlam, atrofik ve dejenere tübüller olarak sınıflandırıldı. Kesitler, Leica DFC 280 ışık mikroskobu ve Leica Q Win Görüntü Analiz sistemi (Leica Micros Imaging Solutions Ltd. Cambridge, UK) kullanılarak incelendi.

İstatistiksel Analiz

İstatistiksel analizler Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) programı (SPSS for Windows version 13) ve MedCalc (2007, Belçika) istatistiksel yazılım programları ile yapıldı. Tüm sonuçlar aritmetik ortalama ± standart hata olarak ifade edildi. Tüm gruplardaki ölçülebilir değişkenlerin Shapiro-Wilk normallik testine göre normal dağılım göstermediği saptandı (p>0,05). Bu nedenle istatistiksel değerlendirmede parametrik olmayan testlerden Kruskal-Wallis varyans analizi tüm değişkenler yönünden grupların genel karşılaştırılmasında kullanılırken grupların ikili karşılaştırılmasında ise Connover testi kullanıldı. P<0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

BULGULAR

Histopatolojik Değerlendirme

Kontrol ve zeytinyağı gruplarına ait testis kesitleri incelendiğinde seminifer tübüller normal histolojik görünümdeydi. Tübüller belirgin bir bazal lamina üzerine oturmuş seminifer epitelinden oluşmaktaydı. Seminifer epitelindeki Sertoli hücreleri ve spermatogenik seri hücreleri belirgin olarak ayırt edilmekteydi. Spermatogonyumlar yuvarlak ve oval şekilleriyle bazal membranın hemen üzerinde yer alırken spermatidler lümende izlendi (Şekil 1A, 1B).

CCI₄ grubunda bazı tübüllerde eozinofilik sitoplazmalı, mayozun belli aşamalarında duraksamış ve farklı şekillerde izlenen dejenere hücrelere rastlandı (Şekil 1C). Ayrıca, bazı seminer tübüllerin lümeninde multinükleer dev hücreler izlendi (Şekil 1D). Bu grupta seminifer tübüllerin %55,00±4,22’si sağlam, %25,00±2,67’si atrofik ve %20,00±1,88’i dejeneratif olarak gözlendi. CCI₄+CAPE grubunda ise tübüllerin %72,14±3,91’i sağlam, %16,42±2,10’u atrofik ve %11,42±2,36’sı dejeneratifti (Şekil 1E, 1F). CCI₄ grubunda etkilenen tübüllerin sayısı kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde artarken (p<0,05), CCI₄+CAPE grubunda etkilenen seminifer tübüllerin sayısının, CCI₄ grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde azaldığı tespit edildi (p<0,05) (Tablo 1).

SONUÇ

Sonuç olarak çalışmamızda, CCl₄’e bağlı testis hasarında CAPE’nin olası etkisi araştırılmıştır ve çalışmamızın sonuçlarına göre, CCl₄’ün testisler üzerinde hasara sebep olduğu ve CCl₄ ile birlikte CAPE verilmesi durumunda testislerdeki bu hasarın belli bir ölçüde düzelme sağladığı gösterilmiştir. Bu bulgular eşliğinde testis hasarının tedavisinde CAPE gibi antioksidan ve anti-enflamatuvar özelliği olan ajanların kullanılmasının, olumlu etkileri olabileceğini düşünmekteyiz.

Etik

Etik Kurul Onayı: Çalışma için İnönü Üniversitesi Deney Hayvanları Etik Kurulu’ndan onay alınmıştır (protokol no: 2012/A-49, tarih: 21.03.2012).

Hasta Onayı: Hayvanlar üzerinde yapılmıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu tarafından değerlendirilmiştir.

Yazarlık Katkıları

Konsept: E.T., Dizayn: E.T., Veri Toplama veya İşleme: B.G., N.V., A.T., H.E., Analiz veya Yorumlama: E.T., Literatür Arama: B.G., Yazan: B.G.

Çıkar Çatışması: Yazarlar bu makale ile ilgili olarak herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Finansal Destek: Çalışmamız için hiçbir kurum ya da kişiden finansal destek alınmamıştır.

Kaynaklar

Frank D, Savir S, Gruenbaum BF, Melamed I, Grinshpun J, Kuts R, et al. Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride (CCl4) Exposure Through an Orogastric Tube. J Vis Exp. 2020;28:10.

Tirkey N, Pilkhwal S, Kuhad A, Chopra K. Hesperidin, a citrus bioflavonoid, decreases the oxidative stress produced by carbon tetrachloride in rat liver and kidney. BMC Pharmacol. 2005;5:2.

Mahmoodzadeh Y, Mazani M, Rezagholizadeh L. Hepatoprotective effect of methanolic Tanacetum parthenium extract on CCl4-induced liver damage in rats. Toxicol Rep. 2017;4:455-62.

Khan MR, Ahmed D. Protective effects of Digera muricata (L.) Mart. on testis against oxidative stress of carbon tetrachloride in rat. Food Chem Toxicol. 2009;47:1393-9.

Türk G, Çeribaşı S, Sönmez M, Çiftçi M, Yüce A, Güvenç M, et al. Ameliorating effect of pomegranate juice consumption on carbon tetrachloride-induced sperm damages, lipid peroxidation, and testicular apoptosis. Toxicol Ind Health. 2016;32:126-37.

Borrelli F, Maffia P, Pinto L, Ianaro A, Russo A, Capasso F, et al. Phytochemical Compounds Involved in the Anti-inflammatory Effect of Propolis Extract. Fitoterapia. 2002;73(Suppl 1):53-63.

Castaldo S, Capasso F. Propolis, an Old Remedy Used in Modern Medicine. Fitoterapia. 2002;73(Suppl 1):1-6.

Dobrowolski JW, Vohora SB, Sharma K, Shah SA, Naqvi SA, Dandiya PC. Antibacterial, Antifungal, Antiamoebic, Antiinflammatory and Antipyretic Studies on Propolis Bee Products. J Ethnopharmacol. 1991;35:77-82.

Sud’ina GF, Mirzoeva OK, Pushkareva MA, Korshunova GA, Sumbatyan NV, Varfolomeev SD. Caffeic Acid Phenethyl Ester as a Lipoxygenase Inhibitor with Antioxidant Properties. FEBS Lett. 1993;329:21-4.

Burdorf A, Figà-Talamanca I, Jensen TK, Thulstrup AM. Effects of occupational exposure on the reproductive system: Core evidence and practical implications. Occup Med (Lond). 2006;56:516-20.

Abraham P, Wilfred G, Cathrine. Oxidative damage to the lipids and proteins pf the lungs, testis and kidney of rats during carbon tetrachloride intoxication. Clin Chim Acta. 1999;289:177-9.

Suzuki K, Nakagawa K, Yamamoto T, Miyazawa T, Kimura F, Kamei M, et al. Carbon tetrachloride-induced hepatic and renal damages in rat: inhibitory effects of cacao polyphenol. Biosci Biotechnol Biochem. 2015;79:1669-75.

Fadhel ZA, Amran S. Effects of black tea extract on carbon tetrachloride-induced lipid peroxidation in liver, kidneys, and testes of rats. Phytother Res. 2002;16(Suppl 1):8-32.

Manjrekar AP, Jisha V, Bag PP, Adhikary B, Pai MM, Hegde A, et al. Effect of Phyllanthus niruri Linn. treatment on liver, kidney and testes CCL4 induced hepatotoxic rats. Indian J Exp Biol. 2008;46:514-20.

Mazani M, Ojarudi M, Banaei S, Salimnejad R, Latifi M, Azizi H, et al. The protective effect of cinnamon and ginger hydro-alcoholic extract on carbon tetrachloride-induced testicular damage in rats. Andrologia. 2020;52:13651.

Horn MM, Ramos AR, Winkelmann L, Matte US, Goldani HA, Silveira TR. Seminiferous epithelium of rats with food restriction and carbon tetrachloride-induced cirrhosis. Int Braz J Urol. 2006;32:94-9.

Volpert R, Elster EF. Biochemical activity of propolis extracts. II. Photodynamic activities. Z Naturforsch CJ Biosci. 1993;48:858-62.

Orban Z, Mitsiades N, Burke TR Jr, Tsokos M, Chrousos GP. Caffeic acid phenethyl ester induces leukocyte apoptosis, modulates nuclear factor-kappa B and suppresses acute inflammation. Neuroimmunomodulation. 2000;7:99-105.

Son S, Lewis BA. Free radical scavenging and antioxidative activity of caffeic acid amide and ester analogues: structure-activity relationship J Agric Food Chem. 2002;30;50:468-72.

Nagaoka T, Banskota AH, Tezuka Y, Harimaya Y, Koizumi K, Saiki I, et al. Inhibitory effects of caffeic acid phenethyl ester analogues on experimental lung metastasis of murine colon 26-L5 carcinoma cells. Biol Pharm Bull. 2003;26:638-41.

Russo A, Longo R, Vanella A. Antioxidant activity of propolis: role of caffeic acid phenethyl ester and galangin. Fitoterapia. 2002;73(Suppl 1):21-9.

Song JJ, Lim HW, Kim K, Kim KM, Cho S, Chae SW. Effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on H(2)O(2) induced oxidative and inflammatory responses in human middle ear epithelial cells. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2012;76:675-9.

Abdou HS, Salah SH, Hoda FB, Rahim A. Effect of pomegranate pretreatment on genotoxicity and hepatotoxicity induced by carbon tetrachloride (CCl4) in male rats. J Med Plant Res. 2012;6:3370-80.

Gülcen B, Kuş MA, Çolakğlu S, Ögetürk M, Kuş İ, Ersoy MA, et al. Deneysel Karbon Tetraklorür Zehirlenmesinde Akciğer Doku Hasarı ve Melatonin Hormonunun Koruyucu Rolü: Işık Mikroskobik ve Biyokimyasal Bir Çalışma. Düzce Tıp Dergisi. 2012;14:37-42.

Ozen S, Akyol O, Iraz M, Söğüt S, Ozuğurlu F, Ozyurt H, et al. Role of caffeic acid phenethyl ester, an active component of propolis, against cisplatin-induced nephrotoxicity in rats. J Appl Toxicol. 2004;24:27-35.

Lee KJ, Choi JH, Khanal T, Hwang YP, Chung YC, Jeong HG. Protective effect of caffeic acid phenethyl ester against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice. Toxicology. 2008;248:18-24.

Atik E, Görür S, Kiper AN. The effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on histopathological changes in testicular ischemia-reperfusion injury. Pharmacol Res. 2006;54:293-7.

Abdallah EAA, El-Refaei MF. Caffeic acid phenethyl ester mitigates infertility: A crucial role of metalloproteinase and angiogenic factor in cadmium-induced testicular damage J Biochem Mol Toxicol. 2022;36:22960.